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在儲存純化蛋白質(zhì)時保持涼爽

蛋白質(zhì)及其功能的研究對于理解生物學(xué)**關(guān)重要,但從復(fù)雜混合物中分離和純化單一蛋白質(zhì)是一項艱苦的工作。投入時間后,使用各種色譜法純化目標(biāo)蛋白質(zhì) 方法,由于儲存不當(dāng)而失去蛋白質(zhì)完整性將是毀滅性的。如果您需要將蛋白質(zhì)用于多個下游研究,良好的儲存條件尤為重要。您可能需要長時間儲存??您的制劑,并且一些實驗要求蛋白質(zhì)保持其原始結(jié)構(gòu),結(jié)合親和力或酶活性。**佳的儲存條件是每種蛋白質(zhì)和情況都不同的; 盡管如此,有可能提出一些蛋白質(zhì)儲存和穩(wěn)定性的一般指導(dǎo)原則。以下是一些快速簡單的建議,涉及濃度,添加劑,樣品大小和儲存溫度,以便在儲存蛋白質(zhì)以備將來使用時考慮。

濃度

濃度在保持蛋白質(zhì)在溶液中穩(wěn)定方面起著關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)需要以高濃度儲存 - **少1 mg / ml。稀釋蛋白質(zhì)溶液(<1 mg / ml)由于與儲存管的低水平結(jié)合而更容易失活和損失。因為在某些情況下濃度較高可能不太現(xiàn)實,所以通常的做法是將“載體”或“填充物”蛋白質(zhì)(如純化的牛血清白蛋白(BSA))加入1**5 mg / ml(0.1%)**0.5%),稀釋蛋白質(zhì)溶液并防止這種降解和損失。

添加劑

可以將許多化合物添加到蛋白質(zhì)溶液中以延長保質(zhì)期。您添加到蛋白質(zhì)溶液中的含量取決于預(yù)期用途和純化蛋白質(zhì)的特性。例如,如果您純化了用于蛋白質(zhì)印跡或免疫沉淀實驗等分析的抗體蛋白,您可以添加冷凍保護劑(如甘油或乙二醇)**終濃度為25%**50%,以幫助穩(wěn)定蛋白質(zhì)。這些添加劑有助于防止溶液在冷凍(-20°C)時凝固,防止形成破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的冰晶。聚乙二醇(PEG)和聚山梨醇酯(如吐溫80)等聚合物也可以幫助保持冰晶,但濃度低得多(0.01%)。因為你的蛋白質(zhì)制劑不會結(jié)冰,它可以多次使用而無需解凍。此外,在此濃度下,吐溫80還可以幫助防止蛋白質(zhì)與儲存管結(jié)合。但是,冷凍保護劑雜質(zhì)可能會影響蛋白質(zhì)活性,因此您可能需要通過與供應(yīng)商核實來采取措施確保所選試劑的質(zhì)量。另一個考慮因素是盡管這些添加劑有利于抗體使用,但高粘度會影響某些下游程序中的蛋白質(zhì)使用,例如額外的色譜步驟,蛋白質(zhì)結(jié)合/相互作用測定或質(zhì)譜分析,因此應(yīng)考慮其他應(yīng)用。因此,您可能需要通過與供應(yīng)商核實,采取措施確保所選試劑的質(zhì)量。另一個考慮因素是盡管這些添加劑有利于抗體使用,但高粘度會影響某些下游程序中的蛋白質(zhì)使用,例如額外的色譜步驟,蛋白質(zhì)結(jié)合/相互作用測定或質(zhì)譜分析,因此應(yīng)考慮其他應(yīng)用。因此,您可能需要通過與供應(yīng)商核實,采取措施確保所選試劑的質(zhì)量。另一個考慮因素是盡管這些添加劑有利于抗體使用,但高粘度會影響某些下游程序中的蛋白質(zhì)使用,例如額外的色譜步驟,蛋白質(zhì)結(jié)合/相互作用測定或質(zhì)譜分析,因此應(yīng)考慮其他應(yīng)用。

可以添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)的蛋白水解切割,從而保持蛋白質(zhì)完整。**終濃度為0.02%**0.05%(w / v)的抗菌劑如疊氮化鈉(NaN3)或終濃度為0.01%(w / v)的硫柳汞抑制微生物生長。金屬螯合劑如EDTA的終濃度為1**5mM,避免了金屬誘導(dǎo)的巰基(-SH)基團的氧化,并有助于將蛋白質(zhì)維持在還原狀態(tài)。**終濃度為1**5mM的還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇(2-ME)也有助于通過防止半胱氨酸的氧化將蛋白質(zhì)維持在還原狀態(tài)。在將添加劑與蛋白質(zhì)混合時,請記住,蛋白質(zhì)溶液不應(yīng)通過渦旋劇烈搖動。

如您所見,有許多添加劑選擇。Bio-Rad等供應(yīng)商提供方便尺寸的試劑,并提供使用添加劑的方案和提示。請務(wù)必閱讀并規(guī)劃下游實驗,以確保正確的儲存條件。

樣本量

如果您確定使用甘油或乙二醇對您的應(yīng)用不利,并且因為凍融循環(huán)會降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,您應(yīng)該分配并準(zhǔn)備一次性等分試樣,這樣一旦解凍,蛋白質(zhì)溶液就不必是再冷凍。這些小等分試樣可以使用一次。訣竅是提前計劃并避免多次凍融循環(huán)。

溫度

通常,蛋白質(zhì)**好在≤4°C的溫度下儲存在干凈,無菌的玻璃容器或聚丙烯管中。在室溫下儲存經(jīng)常導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解和/或不活動。對于短期儲存****幾周,許多蛋白質(zhì)可以儲存在含有蛋白酶抑制劑的簡單緩沖液中,溫度為4°C。對于中期儲存,一個月到一年,在-20°C或-80°C冷凍是更常見的冷蛋白儲存形式。對于長達一年的嚴(yán)重長期儲存,一些研究人員選擇在液氮中將一次性蛋白質(zhì)等分試樣用于在液氮下儲存在干凈的塑料容器中。該方法包括將蛋白質(zhì)溶液逐滴(約100μl/滴)加入液氮池中,然后收集液滴大小的冷凍珠并在液氮下將它們儲存在冷凍瓶中。根據(jù)您的情況和蛋白質(zhì)的特性,您可能會偏好一個存儲溫度和存儲持續(xù)時間。請務(wù)必牢記預(yù)期的應(yīng)用程序。

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